中国人兽共患病杂志1999年第5期第15卷论著
单位：第一军医大学微生物学教研室(广州，510515)
摘要目的用套式PCR快速检测水沟和丛林等地的钩端螺旋体。方法选中的一段保守序列IS1533，设计两对引物，用套式PCR检测六种不同血清型的钩体。结果6株致病株均出现单一246bp的特异性扩增产物而腐生株、空白对照无任何DNA扩增条带。用琼脂糖凝胶电泳，能检测500fg模板的扩增产物。结论套式PCR是一种灵敏度高、特异性强的快速检测自然疫源中钩体的有效方法。钩端螺旋体(简称钩体)病是一种人畜共患自然疫源性疾病具有稻田、洪水、雨水和丛林等流行形式。钩端螺旋体病钩端螺旋体种类繁多，分致病性和非致病性两大类，致病性钩端螺旋体全世界已发现25个血清群、200多个血清型。我国常见致病性钩端螺旋体有14个血清群，主要分布在云南广东、福建和湖北等东南沿海和长江流域1。对钩体进行及时监测，是防治钩体病大规模流行的重要措施。我们应用套式PCR对不同血清型的6株致病性钩端螺旋体进行了研究。
11材料
11菌株标准血清型菌株：波摩那型株、秋季型临4株(56060)、犬型桂44株赖型株、七日热型株和临海型临6株等购自中国医学细菌保藏管理中心钩端螺旋体专业实验室腐生株由中山医科大学微生物学教研室惠赠。
12实验动物所用家兔由本校实验动物中心提供。
13主要仪器及试剂M750B型紫外分光光度计、TGL16G高速离心机、PCR扩增仪(ERICOMPINC)、DNA分子量标准品、TaqDNA聚合酶和4种dNTP(上海复华公司)及SDS琼脂糖。
12方法
11兔血清的制备抽血5070ml,置100ml瓶中4过夜，取血清56灭活30min破坏补体，钩端螺旋体病是由各种不同血清型别的致病性钩端螺旋体简称钩体所引起的一种急性传染病，俗称打谷黄"或稻瘟病"。由于感染的菌型不同，其临床特点也不一样用孔径022m的滤膜过滤除菌。
12钩体的培养柯氏(Korthof)培养基磅15min灭菌后，加入10%兔血清接种钩体，28恒温培养2周，暗视野显微镜下检测其生长和死亡情况。提取钩体纯培养物200l反复冻融23次13，离心15min，用1mlTE缓冲液，1mMEDTA)洗涤沉淀1次，药历网钩端螺旋体病的肾损害频道提供包括钩端螺旋体病的肾损害病因、钩端螺旋体病的肾损害临床诊断、钩端螺旋体病的肾损害诊断、钩端螺旋体病的肾损害治疗和预防等信将沉淀重新悬浮于05mlTE缓冲液中。猪钩端螺旋体病加终浓度05%的SDS50作用1h。加终浓度为3mg/ml的溶菌酶，37水浴30min或加终浓度为04mg/ml蛋白酶K，50水浴30min，酚/氯仿法抽提DNA。定量取不同稀释度的DNA液于紫外分光光度计上测260nm和280nm的吸光值，判断其纯度，钩端螺旋体疫苗功效主治/用途作用/不良反应/副作用/用法用量/药理作用/注意事项,钩端螺旋体疫苗说明书,钩端螺旋体疫苗用药禁忌/药理研究/性状剂型规格/体内过程/药物并计算浓度。
15引物合成选中的一段保守序列IS15333，采用PRIMER软件设计两对引物，并由上海生物工程中心合成。两对引物的序列如下：
外引物W1：内引物W3：和套式PCRPCR反应总体积为50l，其中模板DNA5l、10M引物各为1l、TaqDNA聚合酶05l(1U)，加灭菌三蒸水使总体积为50l，液体石蜡油50l覆盖。阴性对照分别采用腐生株、大肠杆菌DNA为模板另设置不加任何DNA模板的空白对照。
用外引物作第一次PCR扩增，反应参数为，治疗钩端螺旋体体感染宜选用的药物是什么更多患者咨询29岁,重度宫颈糜烂HPV感染,没用生育过!2年前发病,药物治疗1年无效,是否需在孕前进行物理治疗病情5030sec7260sec，共30个循环725min。取第一次PCR产物，稀释1000倍，用内引物再次扩增，反应参数同上。
17电泳检测PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照记录。
18敏感性检测取流感伤寒型和七日热型菌液DNA定量并经一系列10倍稀释后作PCR，电泳检测扩增产物。
2结果
21外引物的扩增结果经过外引物扩增，赖型70091株、临海型临6株和七日热型401株能获得490bp的特异性DNA带，秋季型临4株有非特异性带，而犬型桂44株、波摩那型109株无DNA带(图1)。
图1用外引物检测钩体的第一轮PCR扩增结果
MDNA分子量标准品1赖型70091株2犬型桂44株3秋季型临4株4波摩那型109株5临海型临6株6七日热型401株7空白对照套式PCR的扩增结果6株致病株均出现单一的246bp特异性带，而空白对照无DNA带(图2)。
图2用内引物检测钩体的第二轮扩增结果
MDNA分子量标准品1赖型70091株2犬型桂44株3秋季型临4株4波摩那型109株5临海型临6株6七日热型401株7空白对照套式PCR检测的敏感性将临海型临6株和七日热型401株的模板DNA定量，用外引物扩增，钩端螺旋体病治疗用药钩端螺旋体性脑炎的症状治疗方法临床表现预防用药钩端螺旋体性脑炎,疾病百钩端螺旋体性脑炎的床表现预防用药说明书功效成分适用症功能主治适用症临琼脂糖凝胶电泳能检测到5pg模板的扩增产物。琼脂糖凝胶电泳能检测到500fg的扩增产物(图3)。
图3套式PCR检测七日热型401株DNA模板的敏感性
(A)用外引物扩增(B)用内引物扩增讨论
对致病性钩端螺旋体的检测和鉴定，常采用暗视野镜检法、直接培养法、动物试验法和凝集溶解试验等传统方法4。这些方法耗时数周，且需一套活钩体标准菌种及暗视野显微镜，给钩体检测带来一定困难5。PCR技术用于检测病原体具有操作简便灵敏、快速等特点，其关键在于设计特异性的引物。
IS1533是中的一段插入序列，其相关序列在致病性钩体中广泛存在，但拷贝数和基因位置在不同血清型中有所差异。根据该序列设计和合成的引物对保存在美国钩体病资源中心的182株致病性钩体的DNA进行扩增，结果177株获得阳性结果，与血清学检测的符合率为97%6。
本实验设计的引物来自IS1533序列，采用引物设计软件PRIMER设计两对引物W1/W2、W3/W4作套式PCR，以6株致病性钩端螺旋体为检测对象进行了研究。
结果表明：第一轮扩增后赖型、临海型和七日热型钩体在8481337处有490bp的特异性DNA带所有6株钩体第二轮扩增后在10311276处都有246bp的特异性DNA带，而腐生株钩体、大肠杆菌等阴性对照均无扩增条带。为什么犬型、秋季型和波摩型没出现490bp的特异性带?我们将两对引物交叉配对作PCR，用W3/W2引物扩增，6株钩体分别出现两种类型的DNA带，而用W1/W4引物扩增只有赖型、临海型和七日热型钩体出现一条DNA带，说明保守序列IS1533的10311276区段对致病性钩体有高度的特异性。10311337区段对不同钩体有某种型特异型，有待于进一步分析。
取临海型和七日热为代表作敏感性检测，用外引物作PCR，琼脂糖凝胶电泳检测敏感性能达到5pg;经过套式PCR后，琼脂糖凝胶电泳检测敏感性能达到500fg，检测的灵敏度提高了10%。钩端螺旋体IgG抗体呈阳性哪个医院可以医治？钩端螺旋体IgG抗体呈阳性哪个医院可以医治？咨询同类问题二病原治疗钩体对多种抗菌药物敏感如青霉素、
以上实验说明套式PCR是一种灵敏度高、特异性强的快速检测自然疫源中钩体的有效方法，特别适合于自然环境下水沟丛林、牛尝屠宰尝内涝、山洪等各种疫区的流行病学和临床监测，在钩体病的早期诊断、流行病学调查中，具有重要的实用价值。
(我校中心实验室周峻岭老师参与了部分实验工作，一并致谢)
*本课题受全军医药卫生科研基金资助
4参考文献
1时曼华屠云人，李庆俊等我国钩端螺旋体病地理分布的研究中华流行病学杂志1995，16(5)：猪钩端螺旋体259
2中国医学细菌保藏管理中心编中国医学细菌菌种目录(1993版)北京：北京理工大学出版社1993，万成松，钩端螺旋体张文炳，曹虹钩端螺旋体的几种检测方法生物学杂志，1998，15(13)：犬钩端螺旋体病24
5时曼华，詹洪，聂一新，等一种快速诊断钩端螺旋体病方法的研究中华流行病学杂志，1992，13(1)：